МЕТОДИ РАДІОІМУНОЛОГІЧНОГО АНАЛІЗУ

Одним із найсучасніших методів, які дозволяють швидко і надійно визначати вміст гормонів, ферментів, рецепторних білків у біологічних рідинах і тканинних екстрактах, а також лікарських препаратів, різних органічних сполук, які раніше або взагалі не вдавалося визначити, або для їх аналізу використовували надто трудомісткі методи, є РІМ (радіоімунологічний метод), або метод конкуренції з радіоактивним антигеном.

У РІА (радіоімунологічному аналізі) поєднується специфіч­ність, властива реакціям (антиген-антитіло), з чутливістю і про­стотою, які дає застосування радіоактивної мітки. Для проведення РІА необхідно мати відповідні антисироватки та мічені радіоак­тивною міткою антигени. Функцію мітки антигенів виконує раді­оактивний ізотоп - зокрема 125І, 131І або 3Н. Цю мітку використову­ють потім для виявлення наявності зв’язаного комплексу.

Принцип РІА не обмежується імунними системами. Його можна застосовувати також для інших систем, в яких замість спе­цифічного антитіла буде діяти специфічний реагент або зв’язую­ча речовина.

Для проведення РІА гормонів та інших біологічно важливих сполук використовують готові стандартні комерційні набори ре­агентів (kit), що випускаються багатьма зарубіжними фірмами і вітчизняною промисловістю.

Радіоімунологічні методи вельми перспективні в селекційній роботі для характеристики генофонду селекційних груп тварин, структури їх генотипу, а також виявлення його змін у процесі вдо­сконалення тварин (поглинального схрещування, інбридингу), ві­русології тощо.

Яка історія відкриття методів радіоімунологічного аналізу та їх роль у біологічних дослідженнях?

Класичні методи імунохімічного аналізу, описані ще в кін­ці XIX століття в роботах таких видатних учених, як Ерліх, Бор­де, Ландштейнер, засновані на утворенні антитілами у присутно­сті антигену преципітату (осаду), проте для візуальної реєстрації процесу преципітації необхідні високі концентрації компонентів і тривалий час проведення реакції.

Індикація утвореного комплексу (антиген-антитіло) в розчи­ні може бути здійснена, якщо в один з початкових компонентів реакційної системи ввести мітку, яка легко виявляється відповід­ним високочутливим фізико-хімічним методом.

Досить зручними для цієї мети виявилися ізотопні, фермент­ні, флуоресцентні, парамагнітні мітки, використання яких да­ло можливість збільшити чутливість імунохімічних методів у мі­льйони разів, а час аналізу зменшити до декількох годин.

Нові імунохімічні методи, які базуються на застосуванні мі­чених реагентів, знайшли широке розповсюдження для кількіс­ного визначення біологічно активних сполук найрізноманітні­шої структури - від низькомолекулярних гормонів до високомолекулярних вірусів та цілих клітин.

Найбільший розвитоксеред них одер­жав радіоімунологічний аналіз (РІА), за­пропонований в кінці 50-х років. Завдя­ки можливості визначати мітку, якою був ізотоп 125I в дуже малих концентраціях, вдалося досягти високої чутливості ана­лізу (на рівні пкг/мл). Розробка РІА ста­ла поворотним моментом у розвитку імунохімічних методів аналізу, що поклало початок цілій серії методів з використан­ням різних мічених сполук. За розробку методу його автори Р.йалоу і С.берсон у 1977 р. були удостоєні Нобелівської премії. Ними вперше було визначено рівень інсуліну в сироватці крові. Пізніше, завдяки розвитку ядерної фізики та радіаційної хімії, було створе­но радіоімунні методи визначення в біологічних рідинах концен­трації гормонів, факторів росту, ферментів, аутоантитіл, маркерів злоякісних новоутворень, ліків, наркотиків та інших речовин.

Існують різні варіанти радіоімуноаналізу.

Сьогодні метод радіоімунного ана­лізу широко використовується в лабора­торній діагностиці.

Роль РІА в діагностиці захворю­вань та фундаментальних медичних, ве­теринарних та біологічних досліджен­нях важко переоцінити. Характерними ознаками РІА, які вигідно відрізняють його від інших імунохімічних методів аналізу, є його простота, висока чутли­вість, специфічність, точність, відсут­ність шкідливого променевого впливу на організм. Використання методів РІА дозволяє встановити критерії для диференціальної діагностики, визначення важкості стану пацієнта, оцінки ефективності ліку­вання та прогнозу різних захворювань, сприяє підбору патогене­тично обґрунтованої терапії.

Які основні принципи радіоімунологічного аналізу?

В основі РІА лежить феномен конкуренції - зв’язування ан­титіл з антигеном, міченим радіоактивним ізотопом, що пригні­чується в присутності неміченого антигену.

РІА - це різновид сатураційного аналізу, що ґрунтується на насиченні (сатурації) специфічного зв’язуючого агента речови­ною, яку треба визначити (лігандом) і конкурентній взаємодії мі­чених та немічених лігандів зі зв’язуючими білками.

Отже, фундаментальним принципом сатураційного аналізу є конкурентна взаємодія молекул гормону і специфічного антитіла або іншого зв’язуючого білка. При введенні міченого ліганда (гор­мону, маркірованого радіоактивним ізотопом або кон’югованого з яким-небудь ферментом, наприклад пероксидазою) в систему для тестування відбувається насичення (сатурація) зв’язуючого біл­ка.

Рис. 13.1. Принципова схема сатураційного аналізу.

Мічений і немічений гормони вносять у зв’язуючу систему послідовно (витіснювальний аналіз) або одночасно з подальшим урівноваженням у процесі інкубації. При цьому ліганд додається в надмірній кількості, що забезпечує можливість конкуренції за ділянки скріплення.

Яка імунологічна основа радіоімунологічного аналізу?

Реакції радіоімунотестування in vitro аналогічні реакціям, що відбуваються в імунній системі людини і хребетних тварин in vivo. Імунний механізм еволюціонував як засіб захисту організ­му проти всього чужорідного (або антигенного) і, отже, потенцій­но небезпечного. На проникнення “чужого” організм реагує мобі­лізацією Т-лімфоцитів, здатних знищувати чужорідний матеріал (наприклад, віруси, бактерії), тоді як інші - В-лімфоцити виробля­ють антитіла проти антигенів, що проникли. Антитіла належать до глобулінової фракції сироваткових білків і носять загальну на­зву імуноглобулінів.

Антитіло, будучи складною білковою молекулою, має досить специфічну тримірну конфігурацію. Внаслідок цього певні ділян­ки молекули “експоновані”, відкриті, і тому доступні для взаємодії антигенами. Конфігурацію молекули антитіла в даній ділянці виз­начає те, які атоми присутні в різних сегментах молекули і яким чином ці атоми впливають на інші навколишні атоми. Така конфі­гурація визначає і властивості молекули антигену, саме того ан­тигену, який може бути зв’язаний антитілом у певному локусі.

Антитіла, вироблені до якого-небудь антигену, є специфічни­ми для нього. Однак не всі молекули антитіла мають ідентичну структуру: деякі з них будуть мати однакову композицію, інші бу­дуть виявляти значну варіабельність, яка зумовлює їх гетероген­ність. З гетерогенністю антитіл тісно пов’язана їх перехресна ре­активність, яка означає, що деякі молекули антитіла мають дуже низьку спорідненість до індукованого їм антигену і тому можуть взаємодіяти з іншими молекулами. Перехресна реактивність мо­же пояснюватися й тим, що антитіло не здатне розрізнити антиге­ни внаслідок їх структурної подібності. Остання імовірність тим менша, чим специфічніше антитіло.

Більшість антитіл, виявлених у крові, відносяться до підкла­су імуноглобулінів G (IgG), які є двовалентними. Це означає, що вони здатні взаємодіяти з двома ідентичними молекулами анти­гену. Антигени можуть бути одно-, дво- або полівалентними. Ва­лентність антитіл і антигенів у значній мірі визначають тип реак­ції, яка буде відбуватися між ними в системі in vitro. Полівалентні антигени можуть комплексувати з двовалентними антитілами, утворюючи тримірні гратчасті структури, які дають преципітати й агрегати. При надлишку антитіл комплекси, що утворюються, є нерозчинними. При розчиненні антигену, що зазвичай має місце в класичних реакціях РІА, утвориться розчинний комплекс. То­му при радіоімунологічних процедурах цей комплекс необхідно виділяти з розчину за допомогою тих або інших способів, напри­клад, осадженням антиімуноглобуліновою сироваткою.

Яка хімічна основа радіоімунологічного аналізу?

Радіоімунологічні реакції підпорядковуються фундаменталь­ним правилам хімії.

при якій:

,

де h і к2 - константи відповідно прямої та зворотної реакції;

[Аг], [Ат], і [АгАт] - відповідно молярні концентрації антиге­ну, антитіла та комплексу антиген-антитіло;

К - константа асоціації або рівноваги в напрямку утворення комплексу АгАт.

Константи швидкостей виражаються одиницями л/с, л/год і т.д. Їх можна розглядати як імовірність здійснення реакції. Так, як­що k1 більше від k2, реакція буде прагнути йти праворуч, до утво­рення продукту АгАт. У цьому випадку К буде більше 1. Знання констант рівноваги і концентрації реагентів у рівновазі дозволяє розрахувати вихід продукту.

Хоча точна природа взаємодії антиген-антитіло залишається невідомою, вважають, що система досягає рівноваги під час інку­баційної фази. Згідно із законом дії маси, якщо К рівна констан­ті рівноваги, то

К [Аг] [Ат] = [АгАт],

при умові рівноваги відношення зв’язаного антигену до віль­ного B/F=[ArAT]/[Ar]

де В - зв’язаний і F - вільний антигени.

При типовій радіоімунологічній процедурі концентрація вільного антигену й антитіла, що знаходиться в рівновазі, опису­ється рівняннями:

[Аг] = [Аг - АгАт] і [Ат]=[Ат. - АгАт]

де Аг і Ат - початкові концентрації компонентів. Звідси істин­не відношення зв’язаного антигену до вільного антигену опису­ється:

В/F=[АгАт]/[Аг - АгАт].

Для РІА використовується мічений радіонуклідом антиген, який поводиться так само, як холодний, тому:

B*/F*= [Аг*-Ат]/(Агі* - Аг*Ат],

де Аг* - початкова кількість міченого антигену,

Аг*Ат - кількість зв’язаного з антитілом міченого антигену. Джерелом радіоактивного АгАт в реакції радіоімунотестування є Аг+Аг*+Ат↔Аг*Ат+АгАт. Звідси очевидно, що якщо кон­центрація неміченого Аг буде збільшена при постійній концен­трації міченого Аг*, перший займе більше число зв’язуючих місць антитіла. Результатом цього буде зниження концентрації зв’яза­ного міченого антигену (Аг*Ат). Отже, відношення В*/F*=[Аг*Ат]/[Аг* - Аг*Ат]

повинно зменшуватися у міру збільшення в реакційній сумі­ші холодного антигену. Оскільки немічений антиген отриманий від пацієнта, B*/F* відображає кількість речовини, присутньої в пробі, що тестується. Зміна цього відношення максимальна то­ді, коли концентрація антигену мала порівняно з концентрацією антитіла.

Для радіоімунологічної процедури вважається достатнім 50% скріплення міченого антигену у відсутності холодного антигену. Якщо константа рівноваги є низькою, кількість антитіл, необхід­них для адекватного з’єднання антигену, повинна бути збільшена. Разом з тим, якщо оцінюється конкуренція холодного і мічено­го антигенів за антитіло, надлишок вільного антитіла буде значно знижувати дію холодного антигену в системі. Чутливість тесту- системи для холодного антигену виявиться низькою і в тому ви­падку, якщо мічений антиген має низьку питому радіоактивність. У цій ситуації для задовільного з’єднання міченого антигену та­кож знадобиться ввести в систему більше антитіл.

Чим відрізняються між собою радіоімунологічні методи?

При класифікації радіоімунологічних методів за основу бе­руть природу зв’язуючого агента:

• радіоімунологічний аналіз (РІА) - зв’язуючим агентом слу­жать специфічні до досліджуваного ліганду антитіла;

• методи білковоконкурентного зв’язування - зв’язуючим агентом є специфічні білки сироватки крові (глобуліни, що абсор­бують тироксин, кортикостероїди і статеві гормони);

• метод радіорецепторного аналізу - для зв’язування вико­ристовуються природні клітинні рецептори. Цей метод має дуже високу чутливість, але може застосовуватися для визначення тіль­ки тих речовин, до яких в тканинах є специфічні рецептори. Так, в радіорецепторному аналізі тиреостимулюючих і тиреоблокуючих антитіл використовуються очищені рецептори ТТГ, а для визна­чення рівня вільного Т-4 іноді застосовується тироксинів зв’язу­ючий глобулін;

• імунорадіометричний метод - найбільш поширений в су­часній лабораторній діагностиці - в якості зв’язуючого агента ви­користовуються мічені радіонуклідами антитіла (а не мічений анти­ген), фіксовані на твердофазному носієві, наприклад, полістиролі.

Спільними якостями всіх вищеперерахованих методів є висока чутливість, що обумовлена використанням радіометричних методів реєстрації мічених радіонуклідами лігандів, а також висо­кою специфічністю.

Які реагенти використовують для радіоімунологічного аналізу?

Для проведення радіоімунологічного дослідження необхід­ний добре очищений ліганд (антиген). Його отримують з біоло­гічного матеріалу очищенням методами гель-хроматографії, іо­нообмінної хроматографії, електрофорезу або шляхом хімічного синтезу. Ліганд високого ступеня чистоти порівнюють з відповід­ним міжнародним стандартом і використовують для приготуван­ня стандартної кривої, отримання міченого ліганду та імунізації тварин з метою створення специфічних антисироваток. Розведе­ні стандарти розливають в ампули, швидко заморожують в рід­кому азоті й зберігають при температурі до -20°С тривалий час. Повторні розморожування і заморожування стандартів не реко­мендуються, тому що вони призводять до руйнування біологічно активних речовин.

Другим реагентом, необхідним для проведення РІА, є міче­ний радіонуклідом ліганд з високою питомою активністю.

У імунологічних дослідженнях, як правило, використовують джерела бета-часток (3Н, 14С) або гамма-променів (51Сг, 125I, 131I).

Тритій (3H) - бета-випромінювач з періодом піврозпаду 12,46 років. При бета-розпаді тритій перетворюється в гелій. Макси­мальна енергія бета-частинок тритію досягає 0,018 МеВ. Пробіг бета-частинок в повітрі дорівнює 0,008 м, максимальна проника­юча здатність у м’яких тканинах - 0,008 мм. Під дією тритію в ор­ганізмі порушується швидкість біохімічних реакцій, змінюється структура молекул, відбувається їх іонізація.

Вуглець (14С) - бета-випромінювач з періодом піврозпаду 5568 років. При розпаді перетворюється у стабільний ізотоп азо­ту. Максимальна енергія частинок - 0,155 МеВ. Пробіг частинок в повітрі - 0,26 м, максимальна проникаюча здатність у м’яких тка­нинах - 0,3 мм. При попаданні в організм може викликати різного роду радіаційні ураження і зміну біохімічних процесів.

Хром (51Сг) - перетворюється в стабільний ізотоп ванадію з випущенням гамма-кванта. Період піврозпаду - 27,8 днів. Енергія квантів при розпаді - 0,34-0,62 МеВ. Пробіг гамма-квантів в пові­трі - 60 м, проникаюча здатність у м’яких тканинах - 80 мм. Не­безпека 51Сг зумовлена його гамма-випромінюванням. При роботі з ним потрібно користуватися свинцевим захистом.

Речовини білкової чи пептидної природи, що містять аміно­кислоти тирозин чи гістидин, мітять радіоактивним йодом. Ато­ми йоду заміщують атоми водню в ароматичних кільцях бокових ланцюгів молекули. При цьому зовнішня мітка входить у молеку­лу ліганду. Коли радіонуклідом вибору є йод, перевагу надають ізотопові йод-125. Він має достатньо довгий період піврозпаду - 60 днів і, отже, тривалий термін використання. Низька енергія гамма-випромінювання йоду-125 обумовлює більш високу ефек­тивність реєстрації гамма-квантів сцинтиляційним кристалом, що дозволяє використовувати менші кількості нукліду та спри­яє зниженню опромінення персоналу, який виконує радіоімунологічні дослідження.

Мітка лігандів (антигенів) йодом-125 достатньо нескладна при наявності відповідного обладнання.

В ліганди, що не мають у своїй структурі тирозину чи гісти­дину, вводять внутрішню мітку, при цьому атом водню заміщуєть­ся атомом тритію (Н-3). Це, як вказувалося вище, чистий випро­мінювач бета-частинок з дуже низькою енергією (18 кеВ) і досить тривалим періодом піврозпаду (12,46 роки). Мітити ліганди Н-3 надзвичайно складно, цей процес можна здійснити лише в про­мислових умовах шляхом хімічного, біологічного синтезу або нуклідного обміну.

Кожна мітка має як свої переваги, так і свої недоліки.

Недоліки мічення лігандів (антигенів) йодом-125:

• мітка йод-125 нестійка і при тривалому зберіганні відще­плюється;

• у процесі мічення речовина пошкоджується, в результаті чого знижується її спорідненість із зв’язуючим реагентом.

Переваги мічення лігандів (антигенів) йодом-125:

• отримання сполук з високою питомою радіоактивністю (2000-4000 ГБк/ммоль);

• простота радіометрії проб, для цього необхідний лише сцинтиляційний гамма-лічильник.

Переваги мічення лігандів (антигенів) Н-3:

• дає можливість тривалого зберігання мічених речовин (до 3-6 міс.), однак отримані при цьому ліганди мають низьку питому вагу (до 100 ГБк/ммоль).

Недоліки мічення лігандів (антигенів), мічених Н-3:

• значно зростає вартість дослідження, тому що вимагає до­рогих за ціною сцинтиляційних ^-лічильників, сцинтиляційної рідини, до складу якої входить розчинник і речовини, що мають властивість флуоресціювати під впливом іонізуючого випроміню­вання;

• використання розчинників, що містять ароматичні сполуки.

Третім реагентом, що бере участь у радіоімунологічній реак­ції, є антисироватка, що містить специфічні до ліганду антитіла.

Яким чином отримують мічені йодом-125 ліганди (антигени)?

В основу методів йодування лігандів покладене перетворен­ня від’ємного іону йоду, який має слабку реакційну здатність, у вільний йод, що є більш реакційно здатним.

Найширше для йодування лігандів застосовується метод із застосуванням хлораміну Т, розроблений Хантер; Грінвуд (1962). Він ґрунтується на сильних окисних властивостях хлораміну Т і дозволяє швидко провести мітку антигену йодом-125.

Для виконання йодування необхідні наступні реагенти: натрій- йод-125 без носія (74 МБк) з питомою активністю 3,7-7,4 ГБк/мл, 0,5 М фосфатний буфер (2,4 мг/мл), йодид калію у фосфатному буфері (10 мг/мл), ліганд, який треба визначити (2,5-5 мкг в 0,01 мл фосфатного буфера). Розчин хлораміну Т у фосфатному буфері готують безпосередньо перед використанням і зберігають у тем­ному місці.

У конічну колбу об’ємом 3-5 мл вносять 74 МБк натрій-йод-125, по 0,025 мл фосфатного буферу і розчину ліганда. Після швидко­го струшування додають 0,025 мл хлораміну Т і знову струшують протягом 20-30 с.

Реакцію зупиняють додаванням 0,1 мл 2,5% розчину альбу­міну бичачої сироватки у фосфатному буфері. Очистку міченого ліганду і відділення від непрореагованого радіоактивного матері­алу проводять методом гель-хроматографії на колонці (1х15 см), заповненій сефадексом G-50, яка попередньо була промита фос­фатним буфером, що містить 0,5% розчин альбуміну бичачої си­роватки. Елюцію проводять тим же буфером. Елюати збирають у пробірки фракціями по 0,5 мл. Після розрахунку питомої актив­ності міченого ліганда його розливають в ампули і зберігають при температурі, не вищій ніж -20°С до моменту використання.

Лактопероксидазний метод йодування кращий від методу із застосуванням хлораміну Т тим, що при його застосуванні менше пошкоджується мічений ліганд. При використанні ферменту лактопероксидази ліганд не підлягає дії великих концентрацій окиснювача. Реакція припиняється розведенням розчину без застосу­вання відновника.

Для проведення йодування цим методом необхідні: 100 мкг лактопероксидази, розчиненої в 0,5 мл 0,4 М натрій-ацетатного буфера, яка зберігається в замороженому стані при температурі - 20°С, 74 МБк натрій-йод-125 з питомою активністю 3,7-7,4 ГБк/мл, 0,4 М натрій-ацетатний буфер (рН 5,6), ліганд, що підлягає йоду­ванню (2,5-5 мкг в 0,01 мл фосфатного буфера), розчин перекису водню (1:50000).

У конічну колбу, що містить розчин ліганда, додають 0,025 мл 0,4 М натрій-ацетатного буфера, 100-250 нг лактопероксидази, роз­чиненої в 0,1 мл розчину перекису водню (600 нг). Вміст колби ста­ранно перемішують і через 5 хвилин додають ще 0,1 мл (600 нг) роз­чину перекису водню. Через 15 хв. після йодування мічений ліганд очищають методом гель-хроматографії на колонці (1X 15см) з сефа­дексом G-50 в 0,5 М фосфатному буфері (рН 7,5), що містить 0,5% розчин альбуміну бичачої сироватки. Елюцію проводять так, як бу­ло описано вище при використанні хлораміну Т. При застосуванні лактопероксидазного методу приготування реагентів та умови про­ведення реакції більш складні, ніж при використанні хлораміну Т.

Що представляють собою специфічні до ліганда антитіла?

Антитіла виявляються серед в- і у-глобулінів при електрофо­ретичному розділенні плазми і білків (імуноглобулінів).

Найбільша кількість антитіл міститься в імуноглобулінах G. Вони утворюються в-лімфоцитами та плазмоцитами при специ­фічній штучній імунізації лігандами, які підлягають визначенню.

Імуногенністю відзначаються антигени з високою молеку­лярною масою (понад 1000). Ступінь її збільшується прямо про­порційно до росту молекулярної маси.

Низькомолекулярні речовини (гаптени) здатні зв’язувати­ся із специфічними антитілами, але не викликають імунної від­повіді. Для отримання специфічних антитіл до речовин з молеку­лярною масою менше 1000 необхідним є хімічне зв’язування їх з більш крупними білковими молекулами типу альбуміну.

Яким чином отримують антисироватку?

Антисироватку, що містить специфічні тіла до ліганда, от­римують шляхом імунізації тварин речовинами, що мають іму­ногенні властивості. На моноспецифічність та афінітет антитіл впливають:

• природа й доза імуногену;

• вид тварини, яку використовують для імунізації;

• ступінь чужорідності антигену;

• спосіб введення препарату;

• вид ад’юванта;

• періодичність імунізації;

• час отримання антисироватки.

Однією з найважливіших властивостей антитіл, яка дозволяє виявляти найменші відмінності у подібних між собою молекулах, є специфічність антитіл. Вона залежить від структури антитіл і реагуючого ліганда.

Другою властивістю є афінітет - спорідненість антитіла до антигена. Антитіла можуть реагувати з великою кількістю спо­ріднених між собою лігандів з різною константою спорідненості. Деякі молекули антитіла мають дуже низьку спорідненість до ліганда, який індукував їх утворення, і тому можуть взаємодіяти з іншими лігандами, що називається перехресною реактивністю. Перехресна реактивність пояснюється нездатністю антитіл роз­різняти антигени через їх структурну подібність.

Вибір тварини для отримання антисироватки залежить від кількості необхідної антисироватки. Найчастіше використовують дрібних лабораторних тварин (гвінейських свинок, кроликів, бі­лих щурів), а за необхідності виготовлення великої кількості си­роватки - великих тварин (кіз, ослів, коней). Вони більше підхо­дять для отримання преципітуючої антисироватки, що містить вторинні антитіла. Для імунізації найчастіше використовують 50-100 мкг хімічно чистого ліганда. Для сповільнення всмокту­вання ліганда і посилення утворення специфічних антитіл анти­гени вводять в організм тварини разом з ад’ювантами.

Вид ад’юванта - найчастіше використовують повний ад’ювант Фрейда, який складається із суміші мінеральної олії, детергенту, вби­тих мікобактерій. Щоби отримати водно-олійну емульсію, водний розчин імуногена емульгують у двох-трьох об’ємах ад’юванта.

Періодичність і спосіб імунізації - найефективнішим є внутрішньошкірне введення імуногенного розчину. Доцільно вводи­ти малі його дози (біля 0,025 мл) у велику кількість точок. Такий спосіб введення дає швидку і максимальну імунну відповідь на­віть після одноразової імунізації, що дозволяє зекономити час та імуноген. При множинних внутрішньошкірних ін’єкціях макси­мальні титри антитіл з’являються через 8-10 тижнів і залишають­ся високими тривалий час.

Підшкірне введення, хоча і менш ефективне, проте широко застосовується для отримання антисироватки. Емульсію ділять на 3-4 порції і вводять у різні точки. Повторну імунізацію зазвичай проводять двічі з інтервалом 2-3 тижні.

Кров для отримання антисироватки беруть через 2-3 тижні після третьої ін’єкції імуногенної суміші. Визначають титр анти­тіл, потім антисироватку розводять буферним розчином до опти­мального титру, розливають в ампули і зберігають при температу­рі, не вищій ніж -20°С до вживання.

Оптимальний титр антисироватки, що застосовується для радіоімунного аналізу, встановлюють шляхом інкубації різних її розведень з міченим лігандом. З метою отримання найвищої чут­ливості методу використовують мінімальне розведення антисироватки, яка при відсутності неміченого ліганда зв’язує біля 50% міченого ліганда.

Які буферні розчини використовують для проведення радіоімунного аналізу?

Для проведення радіоімунного аналізу необхідні також і бу­ферні розчини. Найчастіше застосовують такі буферні розчини:

- фосфатний;

- барбітуратний;

- боратний;

- тріс-буфер.

Характер буферного розчину не має суттєвого значення, але його рН не повинно значно відрізнятися від рН нейтрального розчину (допустимі межі 7,4-8,6). Оскільки висока концентрація солей перешкоджає реакції “антиген-антитіло”, іонна сила буфер­ного розчину повинна бути низькою (0,01-0,1 моль). Буферний розчин не повинен містити мікроорганізми, тому до нього дода­ють мертиолат (0,1 мг/мл) чи азид натрію (0,2-1 мг/мл). Буферні системи в деяких випадках містять білок (альбумін бичачої сиро­ватки, желатин або вільну від ліганда плазму).

Для зменшення пошкодження речовин білкового походжен­ня до буферного розчину додають інгібітори ферментів, аналогіч­них до трипсину - трасилол, контрикал по 20 КО/мл (КО-каллікреїнові одиниці).

Які особливості забору біологічного матеріалу для проведення радіоімунного аналізу?

Кров для РІА забирається зранку натще в умовах фізіологіч­ного спокою. Її набирають в попередньо охолоджені центрифуж- ні пробірки, що містять гепарин або натрієву сіль ЕДТА (1 мг/мл). Для попередження руйнування речовин білкового походження протеолітичними ферментами при заборі використовують одно­разові голки без шприца (так званий метод забору крові самото­ком у пробірку). Після цього пробірки легко струшують, центри­фугують при температурі - 4°С, плазму крові переносять порціями в сухі поліпропіленові пробірки, герметично закривають і за не­обхідності тривалого зберігання ставлять у морозильну камеру - 20°С на 1,5-2 місяці. За потреби зберігання плазми до 24 год. мож­на використати звичайний холодильник з температурою до - 8°С. Розморожування плазми і повторне її заморожування недопусти­ме, оскільки значно спотворює результати РІА.