АССОЦИИРОВАННЫЕ С ВОЗРАСТОМ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И КЛИНИКО-ПАТОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ

1НИИ онкологии СО РАМН, Томск,

2НИИ медицинской генетики СО РАМН, Томск,

3НИИ терапии СО РАМН, Новосибирск,

4ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава, Томск

Подавляющее большинство злокачественных новообразований человека являются возраст-зависимыми, заболеваемость растет экспоненциально с возрастом. Более 75% злокачественных эпителиальных опухолей обнаруживают у пациентов старше 55 лет, в частности, именно в этом возрасте у женщин диагностируются более 80% всех раков молочной железы (РМЖ) [1]. Eppenberg-Castori с соавторами при ретроспективной оценке показателей выживаемости у 83 нелеченных пациенток с РМЖ, разделенных на 2 группы: до 46 лет и старше 69 лет – показали 30%–ную десятилетнюю выживаемость у «молодых» по сравнению с 70% в старшем возрасте. При этом выравнивание групп по показателям злокачественности и индекса пролиферации опухолевых клеток не привело к исчезновению различий по исходу, что свидетельствует о наличии пока неизвестных биологических характеристик, обеспечивающих различное клиническое поведение гистологически сходных опухолей, возникающих в раннем или позднем возрасте [2]. Молодой возраст является независимым критерием плохого прогноза. Эстроген-рецептор (ER) отрицательные опухоли чаще встречаются у молодых женщин, тогда как у пожилых преобладают эстроген-рецептор положительные, с повышением уровня экспрессии рецепторов в клетках, при этом существенно снижена доля ERBB и EGFR положительных опухолей.

Прогностически неблагоприятные опухоли (большой размер, вовлечение лимфоузлов, высокая злокачественность, рецептор-негативные) наблюдаются преимущественно у женщин, заболевших в период сохраненной меструальной функции, у пациенток старше 55 лет преобладают прогностически благоприятные опухоли [3].

При оценке стандартных прогностических и предсказательных маркеров (гистологический тип, злокачественность, стадия, индексы апоптоза и пролиферации и ряда ИГХ маркеров: ER, PR, ERBB, EGFR, p53, S2 – было показано, что ER+ опухоли у молодых демонстрируют более высокий пролиферативный, инвазивный, ангиогенный и протеолитический потенциал, более выраженную генетическую нестабильность, чем у пожилых, что потенциально объясняет их раннюю клиническую манифестацию и плохой прогноз.

Клинико-патологические особенности рака молочной железы у больных с сохраненной менструальной функцией и в менопаузе. Примечательно, что даже при одинаковом уровне экспрессии таких биомаркеров инвазивности и ангиогенеза, как протеазы uPA, катепсин Д и VEGF, их прогностическая значимость была показана только для молодых больных РМЖ [2; 4].

Принимая во внимание гормонзависимую природу РМЖ, резонно полагать, что изменение гормонального статуса может модифицировать не только риск формирования РМЖ, но и характер прогрессии.

Однако самостоятельная роль состояния менструальной функции в прогрессии рака молочной железы остается недостаточно изученной. Мы провели исследования по оценке взаимоотношения 3 форм опухолевой прогрессии: формирования первичного опухолевого узла, о котором судили по его размеру, лимфогенного и гематогенного метастазирования у больных РМЖ с сохраненной менструальной функцией в возрасте 35 лет и старше и пациенток, находящихся в менопаузе. Из исследований были исключены случаи рака у женщин моложе 35 лет, существенное отличие патогенеза которого часто обусловлено наследственной патологией генома.

В исследование были включены 389 больных инфильтрирующим протоковым раком молочной железы T1-4N0-3M0 с уницентрической формой роста в возрасте от 35 до 80 лет, находящихся на лечении в отделении общей онкологии НИИ онкологии СО РАМН с 1999 по 2007 г.

В послеоперационном периоде 162 больным проводилась адъювантная химиотерапия по стандартной схемам CMF, CAF, ТС, CAХ и CMХ. 124 больным в постменопаузе назначалась антиэстрогенная терапия тамоксифеном. 122 больные послеоперационного лечения не получали.

Сроки наблюдения за больными составили 5 лет. Анализировались первичные документы – истории болезни и амбулаторные карты больных. Морфологическому исследованию подвергался операционный материал. Оценивалась ткань первичных опухолевых узлов и все аксиллярные лимфатические узлы. Диагноз рака молочной железы устанавливался согласно «Гистологической классификации опухолей молочной железы» (ВОЗ, Женева, 2003).

При исследовании инфильтративного компонента рака молочной железы выделяли тубулярные, трабекулярные, микроальвеолярные, солидные структуры, группы клеток, указывалось количество структур в инфильтративном компоненте в каждом случае. Представительство микроальвеолярных структур в инфильтративном компоненте определялось по трехбалльной системе, где 1 баллом обозначались случаи с наличием микроальвеолярных структур до 10%, 2 баллами – >10% – <75% микроальвеолярных структур, 3 баллами > 75%. Степень злокачественности оценивали по модифицированной схеме P. Scarff, H. Bloom и W. Richardson. При этом учитывали количество тубулярных и протоковых структур, число митозов и клеточный полиморфизм. Иммуногистохимическое исследование проводили по стандартной методике. При исследовании применяли антитела фирмы «Dako» к рецепторам эстрогена (клон 1D5, RTU, мышиные) и к рецепторам прогестерона (клон PgR636, RTU, мышиные).

Проводилось исследование морфологического строения всех аксиллярных лимфатических узлов. При гистологическом исследовании пораженных метастазами лимфоузлов определялся такой параметр, как степень замещения ткани лимфоузла метастазом. Было выделено четыре степени замещения: до 10%; от 10 до 50%; от 50 до 75% и тотальное замещение (более чем на 75% – тотальное).

Обработка полученных данных выполнялась с использованием пакета программ «Statistica 6.0 for Windows». Применялся дисперсионный, корреляционный анализ по Спирмену, критерий ?2, метод логистической регрессии, показатель выживаемости по Каплан-Мейеру. Обсуждаются результаты с достоверностью различий при р < 0,05 и с тенденцией различий при р < 0,1. Особенности строения первичного опухолевого узла, связанные с возрастом пациенток. У больных в менопаузе, в отличие от пациенток с сохраненной менструальной функцией, обнаружены явления «фенотипического дрейфа» инфильтративного компонента первичного опухолевого узла, проявляющегося в нарастании гистологического разнообразия структур инфильтративного компонента по мере увеличения размера новообразования.

При наличии одного типа структур в инфильтративном компоненте размер первичного опухолевого узла составлял:

2,7±1,3 см, двух – 3,2±1,9 см, трех – 2,8±1,2 см, четырех – 3,9±2,3 см (F=4,1; р=0,007).

В группе пациенток с сохраненной менструальной функцией чаще выявлялся положительный рецепторный статус (соответственно: 63,2 и 37,2%; р=0,03), при котором определялись опухоли меньшего размера, в сравнении со случаями с отрицательным рецепторным статусом (соответственно: 1,7±0,7 и 4,2±3,2; F=4,0; р=0,03).

Особенности лимфогенного метастазирования, связанные с возрастом пациенток.

У пациенток с раком молочной железы, находящихся в состоянии менопаузы, частота метастатического поражения регионарных лимфоузлов была выше (71%) при наличии в инфильтративном компоненте микроальвеолярных структур, а при отсутствии таковых в прослеживалась в 25% наблюдений (?2=43,8; р=0,000000). В группе больных с сохраненной менструальной функцией в случаях наличия микроальвеолярных структур лимфогенные метастазы присутствовали в 47% случаев, а при их отсутствии в 32% (?2=3,5; р=0,06). Обнаруженная закономерность имела и количественную выраженность у пациенток, находящихся в состоянии менопаузы, когда частота лимфогенного метастазирования возрастала при увеличении количества микроальвеолярных структур в инфильтративном компоненте. В случаях, когда представительство микроальвеолярных структур превышало 75% от всех остальных, метастазы в регионарных лимфатических узлах выявлялись в 89% наблюдений (?2=51,7; р=0,000000).

Особенности гематогенного метастазирования, связанные с возрастом пациенток. Было обнаружено, что общеизвестная связь вероятности гематогенного метастазирования с количеством пораженных метастазами лимфатических узлов имеет прогностическое значение только у больных, находящихся в состоянии менопаузы.

Кроме этого, у больных, находящихся в состоянии менопаузы, риск развития гематогенной диссеминации был связан не только с выраженностью лимфогенного метастазирования, но и с некоторыми морфологическими особенностями лимфогенных метастазов. Так, гематогенные метастазы обнаруживались чаще (в 84% случаев, р=0,003) при наличии и большом количестве (5,6±4,6) тотально пораженных метастазами лимфоузлов (F =13,2; р = 0,0006), а также при большом числе разных типов замещения метастазами лимфоузлов (р=0,0008).

Таким образом, результаты исследования позволили обнаружить новые морфо-клинические параметры, отражающие закономерности развития трех видов прогрессии рака молочной железы: роста первичного опухолевого узла, лимфогенного и гематогенного метастазирования. Обнаружены существенные различия их проявлений в зависимости от состояния менструальной функции. Главным отличием течения рака молочной железы у больных в менопаузе является связь лимфогенного метастазирования с морфологией первичного опухолевого узла, а гематогенного метастазирования с выраженностью лимфогенного. Наличие определенного биологического фенотипа опухоли в разных возрастных периодах очевидно обеспечивается специфическими молекулярно-генетическими особенностями, сведений о которых в литературе чрезвычайно мало.

Молекулярно-генетические особенности РМЖ в молодом и пожилом возрасте. Недавно начавшиеся исследования роли мутаций ДНК, различий в генной экспрессии, эпигеномных изменений патогенетически значимых для РМЖ сигнальных путей свидетельствуют о разном их вкладе в возраст-зависимые различия клинических проявлений злокачественных новообразований молочной железы. Тестирование мутаций в гене ТР53 показало, что в старшей группе в 1,5 раза чаще встречаются ER+ опухоли с «диким» (нормальным) р53 и в 2 раза реже ER- опухоли с неповрежденным р53, чем у молодых пациенток. Сравнительная геномная гибридизация не выявила существенных различий в частоте геномных аберраций в зависимости от возраста. Однако оценка паттерна генной экспрессии (микроаррей) выявила значительные возраст-специфические различия, а именно, более высокую экспрессию ER, опухолевых супрессоров, индукторов апоптоза, регуляторов дифференцировки при сниженном уровне регуляторов роста и митотических факторов у постменопаузальных больных РМЖ по сравнению с молодыми [6]. Все это указывает на существование различных фундаментальных механизмов развития этих опухолей и требует дальнейших исследований для выявления механизмов этих различий и разработки информативных прогностических критериев гормонзависимого РМЖ.

Старение многоклеточных организмов может рассматриваться как эволюционно сложившийся механизм клеточного ответа для защиты от злокачественной трансформации, поскольку он включает апоптоз и клеточное старение, направленные на элиминацию или предотвращение пролиферации генетически поврежденных клеток [7]. Показана важная роль генов ТР53 и р16(INK4a) в процессах старения и канцерогенезе, которые выполняют 2 рода функций.

С одной стороны, их участие в улучшении метаболических процессов, антиоксидантной защиты, транскрипционный ответ р53 способствуют уменьшению риска генетических повреждений, защищая от рака и старения.

С другой стороны, обуславливающее клеточное старение укорочение теломер и сверхэкспрессия р16 как результат дерепрессии гена INK4aARF, направлены на снижение клеточной пролиферации и предотвращение онкогенеза, но при этом происходит ускорение старения за счет лимитирования регенеративного потенциала популяции стволовых клеток [8].

Белковый продукт гена р53 обеспечивает генетический гомеостаз, поддерживая стабильность генома в условиях генотоксических воздействий. Полученные в последние годы экспериментальные и клинико-эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что ген–онкосупрессор р53, являющийся ключевым регулятором ответа на повреждение ДНК, может играть различную роль у молодых и стареющих организмов. Известно, что р53 опосредованная опухолевая супрессия достигается путем «ареста» клеточного цикла (для репарации повреждений), клеточной смерти в случае нерепарируемых нарушений ДНК, а также индукцией состояния клеточного старения, которое, по сути, является постоянной остановкой клеточного цикла (невозможностью пролиферации). Накопление стареющих клеток приводит к тканевой дегенерации, изменению их функции, и, как следствие, – приобретению клетками микроокружения способности к промоции опухолевого фенотипа [9]. В связи с этим полагают, что высокая активность р53 защищает от злокачественной трансформации в раннем периоде жизни, но ускоряет приобретение фенотипа старения и связанного с этим позднего рака. Наши данные по изучению ассоциации полиморфизма р53 с РМЖ согласуются с вышесказанным. Для женщин в менопаузе мы выявили модифицирующее влияние носительства мажорных аллелей гена TP53 (функционально значимый Arg72Pro–полиморфизм) в сочетании с функционально полноценными генотипами интрона 3 и 6, повышающее риск формирования РМЖ. Эти данные наряду с литературными, указывают на существование различных механизмов вовлечения р53 в патогенез РМЖ у женщин репродуктивного возраста и в менопаузе.

Важное значение в поддержании баланса между старением и злокачественной трансформацией имеют механизмы репарации. Мы ранее показали, что комбинация вариантных генотипов р53 и одного из ключевых генов репарации ДНК XRCC1 ассоциированы с раком легких у молодых курящих индивидуумов, тогда как комбинации нормальных аллелей повышают риск РЛ в возрасте старше 60 лет независимо от фактора курения [10]. Анализ распределения генотипов ряда других патогенетически значимых для РМЖ генов также позволил выявить существенные различия в ассоциациях вариантных генотипов с РМЖ в репродуктивном и менопаузальном периодах. Нами было проведено генотипирование по большой группе не связанных с наследственной формой РМЖ полиморфных генов, вовлеченных в патогенез спорадического РМЖ, включающих гены апоптоза и репарации, интерлейкинов, ферментов метаболизма стероидных гормонов и ксенобиотиков, генов метаболизма фолатов, модифицирующих статус метилирования генома. Мы обнаружили протективную роль вариантного аллеля 677Т (снижение активности фермента) и рисковую значимость нормального генотипа гена ключевого фермента метаболизма фолиевой кислоты MTHFR для женщин с сохраненным менструальным циклом, при этом не выявлено связи с РМЖ для женщин, находящихся в менопаузе. Мутантный генотип del19/del19 гена DHFR, имеющего важное значение в регуляции соотношения процессов ДНК синтеза и метилирования, повышает риск РМЖ только у женщин репродуктивного возраста. Интересно, что полиморфизм обоих генов, играющих важную роль в метилировании ДНК с вовлечением процессов метаболизма фолатов, связан с РМЖ у более молодых женщин, с сохраненной репродуктивной функцией, и не оказывает модифицирующего влияния для менопаузальных женщин. Поскольку MTHFR является одним из ключевых белков, определяющим образование пула метильных группировок для реакций метилирования ДНК, то носительство мутантных аллелей должно приводить к уменьшению вероятности аберрантного метилирования отдельных локусов генома. В этом отношении особый интерес представляют полученные в настоящем исследовании данные об ассоциации генотипов 677CT и 677TT, содержащих мутантный аллель 677T, с позитивным статусом рецептора эстрогена, поскольку известно, что в регуляции экспрессии гена ER значительная роль отводится эпигенетическим механизмам.

Фенотип клеточного старения – арест клеточного цикла, изменение клеточной функции, проявляющееся секрецией факторов деградации экстраклеточного матрикса (ЭКМ), воспалительных цитокинов, ростовых факторов. В последние годы появляется все больше доказательств, что стареющая строма, преимущественно накопление стареющих фибробластов, способствует злокачественной трансформации эпителия путем ремоделирования ЭКМ, промоции инвазии и роста предраковых клеток посредством секреции указанных выше цитокинов [9].

Экспрессирующийся на фибробластах FGFR2 (рецептор к фактору роста фибробластов 2, кодирует рецептор тирозин-киназы) вовлечен в регуляцию роста, инвазивности, подвижности опухолевых клеток, процессы эпителиально-мезенхимального перехода. Он может функционировать как онкоген или антионкоген в зависимости от условий микроокружения. В последние годы в полногеномных исследованиях выявлен высокий атрибутивный риск полиморфизма FGFR2 в формировании РМЖ в европейской популяции, подтвержденный затем для афро-американцев и азиатов [11–13], в России нами и группами исследователей из Новосибирска и Санкт-Петербурга получены данные о связи различных полиморфизмов FGFR2 с РМЖ [14–16]. Полагают, что полиморфизм FGFR2 сайт-специфичен, поскольку не было обнаружено его связи с раком эндометрия, кишечника, простаты [17]. Вариантные аллели приводят к повышению экспрессии FGFR2 на фибробластах. Показана четкая ассоциация полиморфизма FGFR2 с ER положительными опухолями, то есть с определенным патологическим субтипом, которая реализуется через сигнальные пути функционирования эстрогенов и прогестеронов [11; 13; 18; 19]. На выборке в 395 больных РМЖ сибирского региона (европеоидов) мы выявили, что как и в европейской популяции, полиморфизм гена FGFR2 ассоциирован с ER+ и PR+ протоковым РМЖ (р=6,8?10–4, при этом относительный риск составляет 2,77(1,42–5,43) для женщин с сохраненной репродуктивной функцией и 2,09 (1,1–3,97) для женщин в пери- и постменопаузе. В ряде исследований последних лет выявлено взаимодействие полиморфизма FGFR2 и функционально связанных с ним генов MAP3K1, TOX3 с семейной историей и репродуктивными факторами, найдена ассоциация этих полиморфизмов с развитием рака у женщин до 40 лет [20–22]. Показана высокая экспрессия FGFR2 в BRCA ассоциированных опухолях [23]. Все эти данные указывают, что полиморфизм FGFR2 может, по крайней мере, частично представлять необъясненный генетический риск для РМЖ, формирующегося в молодом возрасте, дополнительно к генам BRCA1, BRCA2, ATM, p53, CHEK2 и NBS1 с зародышевыми мутациями, которые ответственны за наследственную неполноценность систем обеспечения целостности генома [16; 24].

Таким образом, генетические варианты влияют на патологические субтипы РМЖ и подтверждают наличие биологических различий его ER+ и ER– субтипов. Выявленные клинико-морфологические и молекулярно-генетические особенности рака молочной железы, возникающего в пре- и менопаузальный период, следует учитывать при изучении механизмов канцерогенеза и опухолевой прогрессии.

Дальнейшие исследования по выяснению этиологической гетерогенности РМЖ позволят уточнить критерии прогноза развития разных форм прогрессии, чувствительности к нео- и адъювантной терапии и исхода заболевания в рассматриваемых группах, повысить эффективность профилактики, ранней диагностики и лечения.

Благодарности. Исследование выполнено в рамках интеграционного проекта СО РАМН «Молекулярно-генетические механизмы формирования и прогрессии РМЖ: разработка критериев риска, прогноза клинического течения и чувствительности к химиотерапии на основании выявления информативных маркеров опухоли и организма».