Приборы контроля биозагрязнений воздуха

Для контроля биологического загрязнения воздуха используются приборы, основанные на инерционном, седиментационном методах и методе фильтрации.

Инерционный метод основан на осаждении частиц микробного аэрозоля из воздушного потока на поверхность питательного агара с последующим инкубированием (проращиванием) осевших микро­организмов в термостате.

Конструкции приборов-пробоотборников инерционного типа весьма разнообразны, но во всех из них действует один принцип — частица аэрозоля при набегании на препятствие (поверхность агара или жидкости) в силу инерции не следует линии тока и не отклоняется вместе с воздухом, огибающим препятствие, а продолжает прямо­линейное движение до столкновения с препятствием (импакция). Приборы, действующие на принципе инерционного осаждения на твердые поверхности — импакторы — бывают щелевыми, с ситовыми решетками и ротационные (центрифуги). В первых аэрозоль входит в щель и далее попадает на вращающуюся чашку Петри с агаром (отечественные приборы: модель 818 — прибор Кротова, В1АР SLITSAMPLER, Швеция). Во-вторых, аэрозоль проходит через решетку с калиброванными отверстиями, диаметр которых рассчитан на инерционное осаждение частиц массой больше заданной. Обычно это частицы размером более 5 мкм. В каскадных импакторах применя­ются несколько ступеней (каскадов) с последующим увеличением скорости (инерции) прохождения аэрозоля через отверстия с мень­шим диаметром отверстий, чем в предыдущей ступени. Таким путем удается осаждать аэрозольные частицы размером от 5,0 мкм и меньше (до 1,0 мкм) и получить распределение частиц аэрозоля по фракциям (импактор Андерсена, импактор Мея и др.) В ротационных импакто­рах осаждение аэрозольных частиц происходит также на поверхность агара за счет центробежной силы.

Импакторы позволяют определять число аэрозольных частиц, содержащих то или иное количество микроорганизмов, находящихся в пробе воздуха определенного объема. Аэрозольные частицы харак­теризуются числом колониеобразующих единиц (КОЕ, в английской транскрипции CFU).

В импинжерах осаждение аэрозольных частиц, содержащих микро­организмы, происходит в жидкости (физиологический раствор - 0,9% раствор NaCI в дистиллированной воде). В жидкости частицы дезагре­гируются, в итоге получается микробная суспензия. Последующий рассев суспензии на чашки Петри и инкубирование в термостате так­же дает рост колоний, однако колония здесь формируется из одной микробной клетки, а не из агрегированных клеток, как это имеет место в импакторах. Таким образом, импинжер дает представление о количестве микробных клеток в отобранной пробе воздуха (или в единичном объеме). Импинжеры не следует использовать как един­ственное средство контроля микробной загрязненности воздуха в чистых помещениях, так как по требованиям GMP в помещениях различного класса чистоты нормируется не количество микробных клеток, а количество аэрозольных частиц, загруженных клетками. К тому же, при контакте с физиологическим раствором в импинжерах значительна гибель клеток.

При выборе того или иного прибора-пробоотборника нужно принимать в расчет величину (объем) отбираемой пробы, которая должна быть достаточно представительной для надежной оценки мик­робной контаминации воздуха в особенности в помещениях высокого класса чистоты. Важное значение имеют диапазон размеров частиц, отбираемых пробоотборником, а также его чувствительность. Под чувствительностью понимается минимальное количество микробных частиц, определяемых в расчете на единицу объема пробы (КОЕ/м¹). Большая чувствительность пробоотборника нужна при оценке мик­робной контаминации воздуха помещений высокого класса чистоты, в особенности при оценке стерильности воздуха. В таблице 16.3 при­ведены характеристики приборов-пробоотборников инерционного типа, применяемых для оценки микробной контаминации воздуха в чистом помещении.

Таблица 16.3

Характеристики приборов — пробоотборников инерционного типа (импакторов)

Отечественная промышлен­ность поставляла щелевой про­боотборник Кротова (модель 818).

Рис. 16.1 Пробоотборник ПУ-1Б, разработанный ЗАО "Химко"

Германская промышленность представила на рынок порта­тивные пробоотборники ротационного типа RCS Plus и Standard RCS (рис. 16.2), способные отбирать пробу объемом до 1000 л, чувст­вительностью не менее 1 и 4 КОЕ /м³ стерилизуемые в автоклаве. Особенностью этих проботборников является применение ленточных кассете агаром вместо чашек Петри. Эти кассеты (AgarStrips) содер­жат стандартную питательную среду в двойной стерилизованной упаковке, производятся в заводских условиях в готовом для исполь­зования виде, удобны для хранения и транспортирования и широко применяются за рубежом.

Рис. 16.2 Пробоотборник RCS Plus фирмы Biotest с набором ленточных кассет с агаром

Для практики можно использовать все пробоотборники, указан­ные в таблице 16.3, за исключением импакторов Андерсена, которые применяются для проведения детальных аэрозольных исследований. Из отечественных приборов самым современным является компакт­ный прибор с автономным электроснабжением ПУ 1-Б.

Седиментационный метод заключается в определении микроб­ных частиц, оседающих на поверхность чашек Петри с агаром. Этот метод не дает количественной характеристики обсемененности воз­духа и служит лишь дополнением к методам пробоотбора, так как на чашки Петри оседают лишь частицы большого размера, в то время как мелкие частицы остаются взвешенными в воздухе и седиментационным способом не идентифицируются. Косвенно этот метод ха­рактеризует загрязнение поверхностей.

Метод фильтрации. Имеются два типа фильтров. Первый — абсо­лютный, отверстия в котором имеют калиброванный размер (напри­мер, "трековые" фильтры из полимерных материалов, отверстия в которых создаются бомбардировкой их с помощью ускорителей). Такой фильтр задерживает все частицы, размер которых больше размера отверстий. Дальнейшая оценка микробной загрязненности может проводиться путем микроскопирования или методом отпе­чатков на питательную среду. Второй тип фильтров — объемный, представляющий собой тонковолокнистую структуру со случайным распределением волокон. Фильтры такого типа часто изготавливают из водорастворимых материалов, например, желатины. В этом случае, при последующем посеве пробы на твердую питательную среду, по­лучают оценку числа клеток, а не частиц, содержащих несколько клеток. Метод фильтрации обычно сопровождается повышенной ги­белью клеток при осаждении на поверхность фильтра по сравнению с методами импакции на поверхность агара.

Наиболее информативным способом определения концентрации микробных аэрозолей в, так называемой, зоне риска — в прост­ранстве с высокими требованиями к асептике, является активный пробоотбор, а не использование чашек Петри с агаром (гравитацион­ный метод). Для этих целей чаще всего используются импакторы и пробоотборники с мембранными фильтрами. Они позволяют опре­делять низкие концентрации биоаэрозолей [15].

При использовании импакторов нужно иметь в виду следующие условия:

1. Скорость импакции на поверхность питательной среды, которая является компромиссом между тем, что:

• она должна быть достаточно высокой, чтобы осаждались час­тицы размером до 1 мкм и

• она должна быть достаточно низкой, чтобы частица не поте­ряла жизнеспособность при механическом ударе о поверхность, и чтобы при этом не происходило разрушение конгломератов микроорганизмов.

2. Объемная скорость отбора есть компромисс между достаточно большим объемом для получения достоверной информации очень низких концентраций микробного аэрозоля и достаточно малым объе­мом пробоотбора, чтобы избежать физической или химической деградации питательной среды.

Число живых частиц желательно выражать в единицах на один кубический метр.

Правила отбора проб воздуха

Результаты контроля микробной загрязненности воздуха зависят от ряда факторов, которые нужно учитывать при планировании и осуществлении контроля. В первую очередь от выбора конкретного типа пробоотборника (производительность, объем пробы, чувстви­тельность и т.д.). Поскольку в чистых помещениях высокого класса чистоты применяется вентиляция с созданием однонаправленного (ламинарного) потока, то важно, чтобы пробоотборник во время работы не вызывал турбулизацию воздуха вокруг пробоотборника, приводящую к искажению результатов. При отборе проб воздуха на поверхность агара нужно учитывать возможный эффект высыхания агара, следствием чего является гибель клеток, попавших на агар. При отборе проб воздуха, имеющего высокую влажность, может наблюдаться конденсация влаги на поверхности агара, особенно, если не предусмотрен последующий подогрев воздуха. При этом вместо колоний отдельных микроорганизмов может наблюдаться сплошной рост на чашке.

В некоторых случаях необходимо соблюдать изокинетичностъ отбора (равенство скоростей воздуха в пробоотборнике и в исследуе­мом потоке). Это важно при отборе проб полидисперсного аэрозоля, при наличии не только мелких, но и крупных аэрозольных частиц. Если скорость потока аэрозоля выше скорости пробоотбора, то некото­рые крупные частицы не будут следовать линиям тока и по инерции будут попадать в пробоотборник, из-за чего результат контроля будет завышенным. При скорости пробоотбора выше скорости потока, он будет заниженным, так как крупные частицы в силу инерции не будут входить в пробоотборную трубку. При совпадении скоростей потока и пробоотбора искажений не будет. Впрочем, для контроля аэрозольных частиц размером 5 мкм и менее (с плотностью 1) нару­шение правила изокинетичности значения не имеет, так как такие частицы следуют линиям тока [9|. Именно такие частицы являются преобладающими в воздухе чистого помещения.

Необходимый объем пробы зависит от ожидаемой концентрации аэрозоля. Если последняя велика, то объем пробы не должен быть большим, иначе на поверхности агара появится несчетное количе­ство колоний. При этом возможно даже многослойное расположение колоний. На практике после предварительного расчета необходимо отобрать пробы для предварительного контроля, объемы которых различаются настолько, чтобы после подсчета результатов контроля можно было установить наиболее подходящий объем пробы. Обычно на поверхности агара должно быть не более 30-40 колоний.

Сложнее обстоит дело с контролем стерильности воздуха (зоны А и В по GMP ЕС). В данном случае необходимо проверить на стерильность воздух в помещении. При длительном отборе пробы высыхает агар, следствием чего будет гибель микробов, попавших на поверхность агара. Представительность пробы воздуха при контроле стерильности ничтожна, что можно видеть на примере простого расчета по формуле вероятности нестерильности [10]:

Р= (1-х)^y

где х — допустимая доля нестерильности, у — размер пробы.

При общепринятом риске нестерильности для парентеральных препаратов х = 10^_6при любых количествах единиц, взятых на про­бу, Р→ 1, т.е. в эксперименте такую высокую стерильность под­твердить нельзя.

Вместе с тем, контроль стерильности необходим для того, чтобы исключить явные случаи нестерильности. Ведь получение положитель­ной пробы свидетельствует о нестерильности (или об ошибках опыта) даже при появлении хотя бы одной колонии в пробе воздуха, взятой, например, из ламинарного шкафа. Поэтому в GMP для воздушной среды такого класса допустимое содержание КОЕ в пробе воздуха в расчете на 1 м³ определено в величину, меньшую единицы.

На практике для зон В по GMP ЕС, где допустимая величина микробной загрязненности не должна превышать 5 КОЕ на 1 м³ объем пробы воздуха не должен быть меньше 1000 л. Повышение предста­вительности пробы может быть достигнуто применением нескольких параллельно работающих пробоотборников.

Располагать пробоотборники следует в тех местах, где находятся наиболее вероятные источники микробной контаминации воздуха, при этом принимая в расчет направление воздушных потоков.

При отборе проб воздуха следует обеспечить такие условия, при которых исключалось бы нарушение нормального технологического процесса, так как отклонение от него, также как и увеличенное число персонала в момент отбора пробы, может привести к сильному искаже­нию результатов.

Перед началом работы приборы-пробоотборники должны быть тщательно очищены и простерилизованы (продезинфицированы). Стерилизацию проводят в сухожаровом шкафу или в автоклаве. Если пробоотборник не может быть подвергнут тепловой стерилизации, его тщательно протирают 70% раствором этилового спирта и затем просушивают. Тепловую стерилизацию допускают пробоотборники типа импактора Андерсена, не имеющих автономного энергоснабже­ния. Импакторы MAC-100, ПУ-1Б, .SAS’ обрабатываются раствором спирта. Недостаточно эффективная обработка пробоотборника может быть причиной получения искаженных результатов.

Питательные среды

Обычно при контроле определяется общая микробная загряз­ненность воздуха. Для этой цели используется мясо-пептонный агар (МПА) — среда №1. Для определения группы кишечных палочек используется среда Эндо — среда № 4, а для определения грибов и плесени среда Сабуро — среда № 2. Описание всех этих сред и способы их приготовления приведены в Государственной Фармакопее.

Приготовленная агаровая среда стерилизуется и в стерильных условиях разливается в чашки Петри. Последние термостатируются в течение 48 ч для определения стерильности, после чего могут быть использованы для контроля в пробоотборниках.